UV Spectrophotometer원리와 DNA의 측정

비공개 조회수 7,456 2018.09.21

흡광도 측정에 대하여 조사를 하려고 해요. 몇가지 질문을 하겠습니다.

1, UV Spectrophotometer 원리가 어떻게 되나요?

2. DNA가 260~280nm파장으로 확인이 된다고 하는데 그런 이유가 있나요?

3. 대학교 교수님께서 260~280nm파장에서 DNA의 양과 질적을 확인 할 수 있다고 하는데 이러한 원리를 알려주세요.

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1 개 답변

ew****

은하신

생물학, 생명공학 26위, 번역, 통역 63위, 영어 분야에서 활동

1, UV Spectrophotometer 원리가 어떻게 되나요?

spectrophotometer란 분광광도계이구요

그 말은 빛을 파장별로 쪼개서 보낸다는 의미입니다.

그런데 모든 물질은 흡수하는 파장대가 다릅니다.

아래 그림에서 보듯이 엽록소 a, b는 각각 흡수하는 파장의 피크가 다르지요?

그림출처: http://www.art-xy.com/2013/03/isolation-of-chlorophyll-and-beta.html

위의 엽록소들은 가시광선대의 파장을 흡수합니다. (430~660nm)

2. DNA가 260~280nm파장으로 확인이 된다고 하는데 그런 이유가 있나요?

그런데 단백질 DNA, RNA는 훨씬 파장이 짧은 자외선을 흡수합니다.

DNA와 RNA는 260nm 파장의 자외선을 가장 많이 흡수하구요

단백질은 280nm 파장을 많이 흡수합니다.

자외선을 흡수하는 부위는 핵산의 염기부분과 단백질중 페닐알라닌, 타이로신, 트립초판같은 방향족 아미노산입니다.

UV spectrometer는 따라서 자외선 파장을 쏴주어 이러한 단백질과 핵산이 흡수하게하고 그 흡수량을 계산하도록 합니다. 즉 수정으로된 cell에 DNA나RNA를 넣고 260nm의 자외선을 통과시키면 DNA나 RNA에 의해서 일정부분 자외선이 흡수되고 나머지는 관통하겠지요? 흡수되는 양을 흡광도라고 합니다.

흡광도가 높으면 DNA가 많은 자외선을 흡수하였으므로 통과하는 자외선은 적으며 따라서 그 말은 DNA 농도가 높다고 하는 것이지요

이 자외선을 쏘아주면 엽록소 등 흡수파장이 다른 물질들은 전혀 흡광도에 영향을 주지 못합니다.

아래 그림은 자외선을 흡수하는 DNA, 단백질의 흡수반응 곡선입니다.

DNA는 260nm, 단백질은 280nm의 peak가 보이지요?

그림출처: https://www.biotek.com/resources/application-notes/low-volume-high-throughput-workflow-for-analysis-of-nucleic-acid-samples-for-biobanking/

3. 대학교 교수님께서 260~280nm파장에서 DNA의 양과 질적을 확인 할 수 있다고 하는데 이러한 원리를 알려주세요.

양은 위에서 설명드린 것처럼 260nm (DNA, RNA의 경우), 280nm (단백질의 경우)에서 최대로 흡수하며 그 흡수하는 정도는 양에 비례하지요?

따라서 흡광도를 이용하여 DNA 정량이 가능합니다.

현재 260nm 흡광도 1.0은 DNA의 경우 50 ug/ml의 농도로 계산하구요

RNA는 40 ug/ml의 농도로 계산합니다. (RNA는 single strand라서 dsDNA의 경우보다 흡수가 더 많습니다)

질적확인은 DNA와 단백질이 서로 섞여있는 경우 순수 DNA와는 값이 다르게 나옵니다.
위의 그림의 파란 곡선이 그런 경우이구요 (초록색 곡선과는 다르지요?)

이럴 때는 260nm/280nm에서 읽은 값의 비율이 1.8~2.0이면 순도가 높고 그 아래이면 단백질 오염이 되어있다고 판정을 합니다.

2018.09.21.

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